膜分离技术在生物制药中的应用

 

    随着基因工程技术的不断发展，由发酵法生产的微生物药物的分离和纯化正面临着一系列新的问题，如含量低 、活性高、易失活、提取收率低等。膜分离过程作为一种新型的分离 技术，在现代生物制药分离工程中具有巨大的应用潜力，得到了广泛的发展，已经用于酶、活性蛋白、氨基酸、维生素、甾体 、疫苗等物质的分离纯化，而膜分离技术在抗生素提炼中的应用也是重点推广的领域之一[1]。 
   成功的生物制品的商业化生产需要经济而又高选择性的分离方法。处理过程视产品价格、生产规模而变化，而各种药物生产过程中所处理的对象很不相同，例如微粒大小、不纯洁度、所需终产品浓度也并不一样。为避免价格昂贵的 色谱分离和热分离方法，选择新的分离固液混合物的分离系统的研究就显得十分重要[2] 
。 
多数抗生素的分子量在300—1200范围，存在于胞外，从发酵液中提取。传统提取方法主要有：吸附法、溶剂萃取法、离子交换法和沉淀法。各种方法各有特点，但工艺往往都十分繁杂，所需时间长，易变性失活，需消耗大量的原料、能耗高、回收率低 、废水污染严重且处理难度大。膜分离过程作为一门新型的分离、浓缩、提纯及净化技术，具有节能，不破坏产品结构、少污染和操 作简单、可在常温下连续操作、可直接放大、可专一配膜等特点，且各种膜过程具有不同分离机制，适于不同对象和要求[3]。由于其特别适合用于热敏性物质的分离，在食品加工、医药等领域有其独特的实用性。用于微生物药物分离和纯化中的膜分离技术主要涉及微滤 、超滤、纳滤 、液膜分离和反渗透等。 
1 膜分离技术在抗生素、氨基酸和酶类分离纯化中的应用 
1.1 膜分离技术的特点 
传统抗生素提炼工艺；发酵液→过滤或离心或大孔树脂吸附、萃取→浓缩→脱色→干燥→产品。 
采用膜分离技术工艺可简化为：发酵液→超滤→纳滤(或反渗透)→脱色→干燥→产品。  
相对于传统工艺，膜分离具有以下优点：大大简化了工艺，一次性投资少 ，维护 、操作简单，运行费用低 ，节省资源 ；运行无相变不破坏产品的结构，分离效率高，提高了产品的收率和质量；不需要溶剂或溶剂用量大大减少，因此废水也更易处理。 
1.2 分离原理 
    根据截留组分的不同，可以将膜过程分为微滤、超滤、纳滤、反渗透、渗透蒸发、渗析、电渗析、气体分离等。用于发酵液后处理的膜技术主要是超滤，其次是纳滤、微滤、反渗透以及液膜分离等 。 
    (1)微滤膜是利用筛分原理，分离截留直径0．O1～10µm以上的粒子，如发酵液中的菌体、细胞、不溶物等。微溶主要应用于细胞收集。液固分离等方面，常作超滤的预处理过程； 
    (2)超滤膜属于非对称多孔膜，孔径在 2～50nm，利用高分子薄膜选择渗透性，在常温下依靠一定的压差和流速，使小于膜孔径的低分子量物质透过膜而使高分子物质被截留。已开发具有不同分子截留的各种超滤膜 (1000～100万 分子量 )，它可按分子大小选择膜孔径，处理发酵液可以截留病毒、蛋白质 、酶、

 
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多糖等大分子物质，对目的产物进行纯化； 
    (3)反渗透的分离基本原理是溶解扩散学说，主要应用于小分子有机物的浓缩 ，只允许溶剂分子通过，盐、氨基酸等小分子被截留； 
    (4)纳滤膜平均孔径 2nm 左右，处理发酵液时截留组分可小到抗生素，合成药、染料、双糖等，允许水、无机盐、有机物等小分子物质通过，截留性能介于超滤和反渗透之间，对目的产物起浓缩作用，由于其操作压力低，对一 、二 价离子有不同选择性，对小分子有机物有较高的截留性等特点，加之膜表面具负电性，抗水垢污染，发展较快[4]； 
(5)液膜萃取是将膜展开成膜相，隔开另两个液相，利用液膜的选择透过性 ，实现物质分离。实质上是萃取与反萃取的结合。液膜法具有操作简便，分离和浓缩能 同时进行等优点。但原料复杂、膜流动载体单一、膜溶胀、稳定性、破裂、堵塞等也是该技术尚未广泛应用的关键问题。液膜是一种均质膜，其中一种形式 为乳状液膜 ，以表面活性剂稳定薄膜，传质速率快、分离效率高、选择性好、节能，近几年来在生物活性物质的分离提取方面受到广泛的重视。液膜萃取技术在抗生素提炼中的应用报道有青霉素、红霉素的提取[5]。 
1.3 膜分离技术在抗生素、氨基酸和酶类微生物药物分离纯化中的应用 
表1分别介绍了微滤、超滤、纳滤、反渗透、液膜分离等五种方法在B一内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类等抗生素以及氨基酸和酶类微生物药物分离纯化中的应用。 
 
表1    膜分离在抗生素、氨基酸和酶类微生物药物分离纯化中的应用 
 2 分离纯化的方式方法 
    根据近年来国内外应用膜分离纯化微生物药物的方式方法，大致有以下几类 。 
2.1 分离方式 
    对于纳滤，可以用以下两种方式对原有抗生素提取工艺进行改进，一是用溶剂萃取抗生素后，萃取液用疏水性纳滤膜处理，浓缩抗生素。可改善操作环境；二是用亲水性纳滤膜对未经萃取的抗生素发酵滤液进行浓缩。除去水和无机盐，再用萃取剂萃取，可大幅度提高萃取过程的生产能力，减少萃取剂的用量。 
2.2 多层液膜分离 
例如红霉素在水／油乳状液滴中的渗透，乳状液滴中一旦形成的浓团，会使分离性能降低。为防止这种情况发生，料液和乳状液应分别为分散相和连续相 (喷雾柱式 接触器中)见 图 1。经过一系列的间歇式和连续式操作，红霉素透过膜相，在抽提相中浓缩 。

 
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膜相，在抽提相中浓缩 。 
 
 
图1  红霉素在喷雾柱式接触器中水/油乳状液滴渗透的示意图[9] 
 
    一般选择低分配系数的油相，因为这样透过率相对低，料液相液滴分散在乳状液滴膜相中。溶质 的渗 透可以从两个路径进行：①膜相分离系数高，溶质直接扩散到膜相中的各个抽提相液滴当中；②膜相分离系数低，溶质从料液相一步步传送到乳状液滴中，再传到乳状液滴表面的抽提相中。这样，可以得到更高的分离效果，同时乳状液膜相稳定性也提 高了[9]。 
2.3 组合分离 
    抗生素发酵液的分离有时候需要1～3个的膜分离操作。第一步固液分离通常应用微滤或超滤，分离得含抗生素 ，盐 和水 的透过 液。透过液的质量决定后序方法的选择，有时需再一次用到超滤，之后用纳滤浓缩 。是否需要中间净化取决于浓缩抗生素的溶剂萃取结果，如果只用了一次超滤、纳滤后萃取结果满 意，就不需中间净化了，否则还需要一中间次净化[10]。 
(1)超滤和纳滤膜组合分离6一氨基青霉烷酸 (6一APA)，是生产半合成青霉素的关键原料。何旭敏等[11]用超滤膜处理6-APA 的钾盐 ，经反应罐中裂解后，在一定温度下，用3mol/I氨水 调节反应液pH=7.5～8.8至裂解完全，再经纳滤膜浓缩，裂解率为97.5% 。 
(2)超滤、纳滤和转相组合分离刘路等[12]应用超滤、纳滤和转相组合分离技术，纯化、浓缩林可霉素发酵液，缩短并优化了传统工艺路线，大大节省溶剂和能源，提高了收率及质量。平板超滤器截留固体颗粒及蛋白质等大分子物质，但对林可霉素、Fe3+、Na +等小分子无截留作用，超滤只起净化作用。第二步用平板纳滤器，压力为2．9～3．0MPa，进液温度12.5℃下，截留铁钠离子，浓缩倍数达10倍以上。浓缩液经转相，减压浓缩、加酸、即可结晶得粗粉，所得晶粒大而均匀，色级比原来淡，质量得到控制，提高了收率。该技术另一个重要意义，是解决了污水治理问题 ，省去了回收溶剂过程，仅在转相时产生小量的污

 
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水。 
(3)超滤和反渗透膜组合分离李十中等[13]先用截留分子量5万的超滤膜处理土霉素结晶母液，除去母液中的悬浮物和大分子物质。然后反渗透膜处理，这一步脱盐率可达99 %。所得浓缩液，再经截留分子量为1万的超滤膜，体积浓缩10倍，*后调pH值从土霉素结晶母液回收土霉素，得到土霉素的纯度82.9% ，效价771u／mg，回收率62% 。 
2.4 膜分离技术与传统的分离技术相结合 
膜分离技术与传统的分离技术相结合，发展出了一些全新的膜分离过程，在 不同程上吸取了膜分离和传统分离方法的优点而避免了两者原有的缺点，是膜 技术发展的主要方向。李十中等[14]利用超滤/萃取法提取青霉素G、红霉素和麦 迪霉素，通过比较，发现新工艺收率和质量明显优于传统的萃取法，而且不需要加破乳剂，静置分层快，不需要离心分离或活性炭脱色。可以看出这种结合在抗生素生产中的应用前景是令人鼓舞的 。 
2.5 膜过滤装置的选择 
膜过滤组件大致可分为四种型式：即管式、中空纤维式、螺旋卷绕式和平板式，各种型式组件的性能比较见表2。 
 
表2 各种超滤器性能的比较

板式和管式多用于小批量的浓缩生产，卷式和中空纤维组件由于填充密度 
高 ，易规模化生产，造价低，可大规模应用[1]。 
超滤过程的操作方式超滤系统可以采用间歇操作或连续操作。连续操作的优点是产品在系统中停留时间短，这对热敏或剪切力敏感的产品有利，主要用于大规模生产。主要缺点是在较高浓度下操作，故通量较低。间歇操作平均通量较高，

 
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所需膜面积较小，装置简单，成本也较低，主要缺点是需要较大的储槽。 
3 面临问题、解决方法和发展方向 
3.1 面临问题 
    (1)浓差极化  浓差极化是指分离过程中，料液在压力驱动下透过膜，溶质被截留，于是在膜与本体溶液界面或膜界面区域浓度越来越高，引起渗透压增大，在膜表面形成沉积或凝胶层，增加透过阻力，改变膜的分离特性，使膜发生溶 胀或恶化膜的性能，导致结晶析出，阻塞流道[1]。 
    (2)膜污染  膜污染是指处理物料中的微粒、胶体粒子或溶质分子与膜发生物理化学相互作用或因浓度极化使某些溶质在膜表面浓度超过其溶解度及机械作用而引起的在膜表面或膜孔内吸附、沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透 
过流量与分离特性的不可逆变化现象[1]
。 
3.2 解决方法 
3.2.1 膜的处理 
    (1)使用复合膜  在膜上可涂上一层聚乙醇乙烯，改善亲水性和膜表面的光滑度，以免膜污染和提高产物渗透性。Zhang等用哌嗪和 trimesoylchloride界面聚合的复合膜用于抗生素的分离，其分离效率 与商用纳滤膜媲美。分别用平板式和螺旋卷式纳滤膜浓缩 793.7～992.1U 的大环内酯类抗生素，截留率可达99% ，浓缩倍数在实验室为10倍左右，中试阶段为4倍以上 。 
2)改变膜的表面极性和电荷  在膜制备时，改变膜的表面极性和电荷，常可减轻污染。也可将膜先用吸附力较强的溶质吸附，如聚砜膜可用大 卵磷脂的乙醇溶液预处理，醋酸纤维膜用阳离子表面活性剂处理。辐射嫁接的方法是膜表面改 性的途径之一。Shim等采用7一射线辐射，将亲水性的甲基丙烯酸一2一羟乙酯单体嫁接到聚丙烯超滤膜表面上并用改性后聚丙烯膜对牛血清蛋白溶液进行超滤处理。发现溶液通量增加膜的抗污性增强，同时膜表面的亲水性增强 。    (3)无机材料膜  近几年开发的新型制膜材料，主要有陶瓷、玻璃和金属。 目前国内处于实验室研究阶段。该膜突出的优点是耐高温耐溶剂性能好，不易老化。可再生性强、耐细菌和强度高等。有报道制备了7一氧化铝复合膜，并在其表面形成硅烷层。改进了膜的截留性能。无机陶瓷膜经多年的发展，在众多领域获得了广泛应用，成为膜领域发展*迅速、*有前景的品种之一。 
    (4)过程处理  抗生素的发酵液中成分比较复杂[2]，对料液进行预处理，除去菌体，悬浮杂质，悬浮胶体，可减少膜表面污垢附着量；另外，亲水膜及膜材料的电荷与溶质电荷相同的膜具有好的抗污性能，由于发酵液组成复杂，造成污染因素各不相同，应在不同条件下进行选择。 
    膜孔径的选择  孔径过大，造成孔堵塞，不仅不会得到高渗透率，还会造成膜清洗困难 ； 
    pH值的控制  溶液中pH对蛋白质、多肽等水中的溶解性、荷电及构型有很大影响，一般把pH调至远离其等电点，可减少膜对蛋白质的吸附量； 
操作条件的选择  提高膜表面上切线流速有助减缓污垢形成，通常过高切线速度增加能耗，使膜表面接触料液浓度增加； 
    操作方式  通常采用错流方法实现生物产品的澄清浓缩纯化精制。在超滤 中增大料液流速会减少浓差极化层厚度，从而使通量增大。中空纤维超滤组件可

 
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采用频繁反洗操作减缓污垢物在膜表面的富集。中空纤维微滤组件可采用吹气人料液的方法，也可从渗透液处压人空气。近年，发展较快的脉冲操作方式，即在料液或渗透液频繁改变操作压力，频繁流体脉冲可减缓污垢层形成，得到恒定 的高渗透率。无机盐从二方面对膜污染产生重大影响 ：①无机盐复合物会在膜表面沉积，或使膜对蛋白质的吸附增强而污染膜；②无机盐改变了溶液的离子强度，影响到蛋白质溶解性、构象和悬浮状态，使沉积层的疏密程度改变，而影响透水率 。 
    操作温度的选择原则  在不影响料液和膜的稳定性范围内，尽量选择较高 的温度，使系统膜通量增大。一般应在低于1O℃下分离浓缩为好。 
   对于乳状液膜影响条件多集中在搅拌速率、载体、表面活性剂和pH值。搅拌速率的增大，增加乳状液滴的分散程度，乳粒变小，外相和乳粒接触面积增大，初始提取率随之增大；但乳粒越细越易破裂 。使已提取的青霉素又重新释放到外相中去。载体三辛胺量大，提取率高 ；但过多的三辛胺会破坏油膜的稳定性，反而使提取率下降。表面活性剂用量直接影响乳糜微粒的分散度和液膜的稳定 性 ，进而影响转运过程：用量少 。膜不稳定易破裂，分散度小，乳粒大。提取率随之降低；用量大，则油相黏性增强阻碍溶质的转运，提取率也下降。在红霉素的分离实验中，因乳状液滴中形成的浓团会使分离性能降低，用喷雾柱式接触器将料液相和乳状液分为分散相和连续相，可得到更高的分离效果，乳状液膜相稳定性也提高。 
由上可以看出，适当运用膜的各种特性，改进膜分离性能，是其在抗生素工业生产中的一个关键条件 。 3.2.2 膜清洗  
膜的长期运行中，膜污染问题必然产生，因此必须采取一定的清洗方式，使膜面或膜内污染物去除，达到透水量恢复，延长膜寿命的目的。对膜清洗多见为物理法和化学法或两者结合起来。物理清洗时借助于高流速液体流动所产生的机械力将膜面上的污染物冲洗掉，或海棉球机械擦洗和反洗等，其特点是简单易行，不引入新污染物。化学清洗常用清洗剂有：酸、碱 、酶 (蛋 白酶 )、螯合 剂、表面活性剂、过氧化氢、次氯酸盐、磷酸盐、聚磷酸盐等[1]。另一种是生物清洗，即借助微生物、酶等生物活性剂去除膜表面及膜内部的污染物。后两种清 洗都存在 向系统引入新污染物的可能性，运行与清洗之间的转换步骤较多。 
3．3 发 展 方 向 
    膜分离技术与传统的分离技术相结合，发展出了一些全新的膜分离过程。例如 ：膜蒸馏、膜萃取、膜反应、亲和膜分离等。这些新的膜过程在不同程度上吸取了膜分离和传统分离方法的优点而避免了两者一些原有的缺点 ，是膜技术发展的主要方向。 
    膜技术现今的发展主要集中于高分辨应用，包括改进蛋白质一病毒分离，蛋 白质切线流分离和膜色谱。这些发展将使膜技术在生物制药分离工程中扮演一个重要地位 。膜色谱技术已应用于现代生物制药的下游纯化过程，当前研究膜技 术的注意力主要在保持膜分离的高通量的同时，使分离更具选择性。所以人们对膜材料的选择，模式，过 程设计 等更为 留心。 
4 结语 
   目前的膜分离技术在抗生素提炼过程中的应用研究非常活跃，但实际应用还 

 
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不够广泛。原因有：一是作为一种迅速发展起来的新型分离技术，膜分离过程本身仍存在许多技术问题有待攻克，诸如高分离因子及高渗透通量膜的制备，高稳定性 ，耐污染清洗膜组件的研制；二是发酵液是一种复杂的介质，黏度、浓度和颗粒大小都不一样，甚至会有多种与主产品高度相似的副产品，对膜分离的选择性有很高要求：三是医药行业对卫生要求极严，膜容易被污染；*后试验采用的膜组件应由自制转向标准化，这将有利于试验结果的可靠性的提高。膜分离技术突出的优点和其广阔的潜在市场使得各国研究者始终没有停止对其进行深入研究的步伐，展望21世纪的膜分离技术将在微生物制药中发挥更为重要的作 用 。