去糖牛奶的制备方法
一种从牛奶或乳清水中提取高纯度蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种从牛奶或乳清水中提取高纯度蛋白的方法 背景技术
本发明涉及一种用搅拌罐同时从牛奶或乳清水中提取高纯度的乳铁蛋白
(bovine lactoferrin, 缩写为BLF)、氧化酶蛋白(bovine lactoperoxidase， 缩写为BLP)以及乳铁蛋白和氧化酶蛋白混合物的方法。氧化酶蛋白和乳铁蛋白 有着广谱的抗菌，抗病毒及提高机体抗病的免疫功能。例如BLP能够破坏病菌的 细胞质，抑制病菌生长过程中的核糖核酸的合成。因而其对革兰氏阳性菌及革 兰氏阴性菌，酵母如白色念珠菌，以及霉菌如黑曲霉菌都有抑制作用。哺乳类 动物中的分泌物中存在氧化酶蛋白，特别是乳汁中。但其浓度在初乳中很低， 4-5天后其浓度迅速增加作为母体传给初生儿的抗菌素。因为初生儿的免疫糸统
尚未发育健全，需要从母乳中得到保护以抵抗入侵的病菌及病毒。
牛乳铁蛋白（BLF)是一个含铁的糖蛋白，与氧化酶蛋白相反，其在初乳的浓 度很高，几天后其浓度就迅速下降。BLF也是一个很广谱的抗菌蛋白。它可以将 铁离子从病菌中抢过来，从而使病菌失铁受抑制或死亡。所以BLF对革兰氏阳性 菌如金黄色葡萄球菌，链球菌等；革兰氏阴性菌如大肠杆菌，痢疾杆茵，及志 贺氏杆菌；幽门螺旋杆菌，流感病毒，湿麥病毒及涎腺病毒都有抑制作用。
由于单纯的BLP及BLF都具有生物抗菌蛋白的功能，它们两种一起的混合物 也应具有抗菌，抗病毒及提高机体免疫力的功能。
已有报导的已实验室规模分离出BLF,如用DEAE, S印hadexC50, CMSephaseFF, CMToyopear 1 ， BioradMacro-preCM， Dowx-mac-3以及Pur i 1 i teC115 离子交换树脂。但这些方法是将树脂装柱使用并且采用缓冲液。这样的方法是 不适用大规模的工业生产实践。由于BLF及BLP在牛奶中的浓度很低，要生产出 有商业经济价值的，高纯度的BLP与BLF必须要釆用极大量的牛奶以提供足够的 BLF和BLP,比如说要日产20公斤纯度为96y。以上BLF，假设其总收率为80°/。，原料 牛奶中的BLF是180mg/L。这就需要160吨牛奶。而且这160咱牛奶的处理时间必 须要在10小时内完成，因为要考虑到过长的加工时间不但会增加牛奶染菌的机 会，而且要留出时间给离子交换树脂柱再生及卫生消毒以准备第二天的工作。 再者由于牛奶中离子强度约为6-7mS(毫西门），导致BLF与BLP的吸附动力学很 慢，约需50分钟才能达到总量的60。/。以上。因此必须要给予树脂和牛奶有足够的 接触时间。同时为了使牛奶中尽可能多的BLP， BLF与树脂交换官能团接触生产 交换反应，必须耍保证一定牛奶流动的线速度，这就是说，柱中线速度越大，
其树脂吸咐动力学就越快。比如说柱中的线速度至少要在100cm每小时以上 (1.6cm每分钟），对一个直径为50cm的园柱来说，要达到l. 6cm每分钟的线速度， 其体积流量就至少要在3. 2升每分钟。如果接触时间不少于50分钟的话，柱的长 度要在83cm以上。但是当柱的直径超过30cm时其柱长度超过50cm的话，就很难 保证其流量及装柱的质量。因而上述这些离子交换树脂是为实验室规模设计， 都不具备在工业规模条件下仍保持高流量的性能，因此无法应用于如此规模的 生产过程。再者如果在解咐的过程中釆用缓冲液，还大大的增加生产成本，使 产品无法竟争，这更是工业生产上不可取的。
也有报导釆用超滤膜来从乳清中分离BLF，但此法生产出的BLF的纯度很低， 只有约30%左右。其中的一个可能的因素就是BLP和BLF的分子量很相近，现阶段
的超滤膜技术是不可能将这两种蛋白分开。
有报导用等电沉淀法来提取BLF，但由于BLF与BLP的等电点很相近，此法无
法生产出高纯度的BLP及BLF。
有报导使用肝素琼脂亲和色谱来提取BLF，但此法的生产成本太高，无法实
现工业规模。 发明内容
为解决现有从牛奶或乳清水中提取高纯度蛋白技术不能低成本进行大工业 生产的问题。本发明提供一种用搅拌罐同时从牛奶或乳清水中提取高纯度的乳 铁蛋白、氧化酶蛋白以及乳铁蛋白和氧化酶蛋白混合物的方法。
本发明的技术方案如下：
一种从牛奶或乳清水中提取高纯度蛋白的方法，它采用放置阳离子交换树 脂的搅拌罐来吸附、解附、分离提取牛奶或乳清液中的乳铁蛋白、乳氧化酶蛋 白及其两者混合物，并辅以膜分离技术将其分离浓缩和高度纯化。
搅拌罐可调搅拌浆转速为20—100rpm;罐内侧壁有增涡流挡板，罐底设置 带过滤板的树脂床，在树脂床上的树脂层上方8-12cm高度处设置快速导流抽滤 管。罐内设置供自动控制的各种传感器pH计，重量计，导电率计及温度计，罐内 液体保温温度为3-16 0°C。树脂为SPC70树脂，树脂吸附解附的次数和条件可 以根据不同产品和产品纯度的要求设定；树脂的吸附时间为20—180分钟，吸附 温度在3-3(TC。树脂的吸附时间为35—60分钟。树脂的解附釆用两级盐浓度解 附乳铁蛋白、乳氧化酶蛋白。第一级盐浓度为1一2.5%，解附乳氧化酶蛋白，解 附时间为30-100分钟；第二级盐浓度为3. 5—7%,解附乳铁蛋白，解附时间为 30-100分钟；解附乳氧化酶蛋白及乳铁蛋白混合物的盐浓度为3-7%解附时间为 30—IOO分钟；解附的搅拌速率为20-100rpm。树脂解附所用的盐是钠盐、钙盐， 钾盐；树脂在经吸附和解附工艺过程后，无需再生活化，只要在解附工艺结東 后用反渗透水（RO水）漂洗树脂至其离子强度低于l. 6ms即可供下一批次吸附之
用。膜分离技术使用0.05—0.1微米的微滤膜将乳铁蛋白，乳氧化酶蛋白的解
附液除菌，去残余的脂肪与其它小颗粒；用1K一30K分子截流量的超滤膜进行脱
盐和浓缩。高纯度的乳铁蛋白是将经上述工艺吸附解附脱盐浓缩的乳铁蛋白浓
液再经过一次弱酸型阳树脂如CM树脂的吸附解附和超滤膜的浓缩获得的。将吸
附、解附、脱盐浓縮的乳铁蛋白浓液，乳氧化酶蛋白浓液及其乳铁蛋白，乳氧 化酶蛋白混合浓液进行真空低温干燥或低温喷雾干燥成粉混合物。
釆用搅拌罐而不是装柱的形式来进行吸咐及解咐的过程。从而不用装柱及 担心树脂柱短路的问题。可以增加搅拌速度以增加吸咐解咐的动力学速度。在 搅拌罐中增加挡板，从而使蛋白的传递速度更快。另夕卜点更重要的是，在罐中 树脂床表面上安装-抽滤简来加快排液速度，于便大工业生产。 附图说明
图l为本发明的工艺流程简图 具体实施方式
1、 采用搅拌罐而不是装柱的形式来进行吸咐及解咐的过程。从而不用装柱 及担心树脂柱短路的问题。可以增加搅拌速度以增加吸咐解附的动力学速度。 在搅拌罐中增加挡板，从而使蛋白的传递速度更快。另外-点更重要的是，在罐
中树脂床表面上（图1中T2罐中的虛线）安装-抽滤筒（图1中T2罐中的FT)来加快 排液速度。这是因为当吸咐及解咐结東时，搅拌浆停止搅拌。树脂在重力作用 下沉积罐底的过滤板上（图1中T2罐中的水平粗黑线)形成树脂床。这时如果树脂 颗粒太细或太软就会造成液体难以通过树脂床，从而造成罐底排液的流量变小， 作业时间过长，产率下降。为了加快排液速度，在树脂床表面上安装-抽滤管， 使大部分的液体不经树脂床而直接经抽滤管及阀门V25， V5， VM1及V6排出。当 罐中的液位降到树脂床表面时，抽滤管FT停止抽液，罐中剩余液体经罐底V5， VM1及V6抽出。这样的过程就大大改善排液的速度。
2、 本法不需对原料牛奶或乳清水调节pH及离子强度。而利用牛奶或乳清水 的自然pH及离子强度。其正常pH值应为6. 2-6. 9
3、 本文中指的牛奶是指加热或未加热消毒的新鲜奶或不新鲜的牛奶以及用 奶粉配制成的牛奶。
4、 此法可直接釆用全脂牛奶及脱脂牛奶。或者是用奶粉配制成的还原全脂 或脱脂奶。
5、 此法可直接应用乳清水。
6、 阳离子交换树脂均可作为此法的BLF及BLP的吸,树脂，但SPC70是为本 法首选吸咐树脂。
7、 本文釆用的吸咐时间20-UO分钟，吸咐时间过短，收率过低，吸咁时间 长，可提高收率，但耍考虑过长的加工时间。吸咐及解《#温度可在3-16度C。8、 采用两级盐（氯化钠）浓度解咁BLP及BLF。第一级盐浓度为1-2. 5%解咐 BLP,解咐时间为30-IOO分钟。第二级盐浓度为3. 5-7。/。解咐BLF,解咐时间为
30-100分钟。
9、 本法解咐中所用的盐，可以是钠盐如氯化钠等，可以是钙盐如氯化钙等， 也可以是钾盐如氯化钾等。但本文首选氯化钠。
10、 本法可连续生产，即树脂不需另外再生， 一埃解咐结東后，用反渗透 水（R0水）洗树脂至其离子强度低于1.6mS即可开始下一批的吸咁。
11、 搅拌罐中的搅拌速度在30-70rpm。
12、 采用0.05-0.1微米的微滤膜除菌及残余的脂肪，微小颗粒等
13、 收集的BLP及BLP的洗脱液（解咐液）用1K-30K分子截留量的超滤膜进行
脱盐及浓缩。
14、 如要生产高纯度的BLF,脱盐并浓缩好BLF再经过一次弱酸型的阳树脂 如CM树脂的吸咐（图1中的T7罐）以除去其中少量其它杂蛋白。
15、 浓缩后的BLP及BLF的混合液，BLP溶液及BLF溶液可用冷冻干燥法干燥 (图1中的FD)也可用喷雾干燥（图1中的SD)。*后蛋白粉包装（图l中的方块箱）。
16、 超滤膜的滤出盐水可用反渗透装置(RO)或电渗折装置回收盐水，同时 RO滤出水可作生产用水。
图1中的T1为奶罐或乳清水罐。原料从T1罐输送到搅拌罐T2后，搅拌60-120 分钟。吸咐结束后，停止搅拌3分钟让树脂自由沉降后，再由抽滤菅FT， VM1， V5, V6将吸咐过的奶液输送到T3罐。此奶液仍含一定浓度的BLP及BLF，所以仍 可考虑作为牛奶或其它奶制品用。
经V3阀门用RO水淋洗树脂（如是全脂或半脂奶，要用34度C的RO水淋洗）3次 以上，以除去残余的奶液及脂肪。淋洗液经阃门V4排出。
(1) 生产BLP及BLF混合蛋白；
从V2阀门加入5-6yo盐水后，撹拌60-IOO分钟后，停止搅拌3分钟让树脂自 然沉降，再经FT， V25, V5及VM5将解咁液输送到TMF罐。
经O. l微米的微滤膜将解咐液中的微粒及脂肪除掉。微膜滤液再经VM2及V8 输送到T4罐。再从T4罐经V18, V15由超滤膜脱盐并浓縮到蛋白浓度6。/。以上。其 中V13及V8是超滤膜的回流管路，V7是加水阀门。
BLPF的浓縮液经V21输送到喷雾千燥器干燥或者经V20输送到冷冻干燥器干 燥后得干粉成品。粉未为淡棕绿色。
加RO水经V3阀门淋洗在搅拌罐T2己解咐后的树脂直至离子强度低于1.6毫 西门。淋洗废液从V4阀门排出。搅拌罐T2现侍命准备下一轮吸咐。
(2) 生产BLP单体及BLF单体；
第一级盐水解咁BLP;从V2阀门加入1.6-2. 5%盐水（氯化钠盐水），搅拌 40-80分钟，停止搅拌3分钟开始抽滤解咁并经V25， V5， VM5输送到TMF罐，然后 再经V2用1. 6-2. 5%盐水淋洗树脂3次，淋洗液经V25， V5, VM5排到TMF罐。
第二级盐水解咐BLF;从V2阀门向己完成第一级解咐的树脂加入4-6。/。盐水 (氯化钠盐水），搅拌60-12G分钟。
在第二级解咐的同时，微滤膜单元也同时对第一级的解咐液进行过滤。滤 液经VM2， V10输送到T5。过滤结東后，清洗微滤膜单元以准备接受第二级解咐 液。
第二级解咐时间结東后，将BLF解咐液经V25， V5， VM5排入到TMF罐后，由 V3阀加RO水淋洗树脂3次以上至离子强度为1.6毫西门以下。淋洗液合并到TMF 罐。此时搅拌罐T2巳恢复侍命状态淮备下一批生产。
开动微滤单元过滤在TMF罐中的BLF解附液。过滤液经VM2， V12输送到T6罐。
在T5及T6的BLP解咐液及BLF解咁液先后由超滤膜单元脱盐浓缩。然后BLP 经V17输送到干燥单元。干燥后的粉未为棕绿色。
对要生产高纯度的BLF则耍经过在T7罐中的阳离子树脂除去残余不纯的奶 蛋白。BLF的脱盐溶液经V16， V23输送到T7罐，撹拌吸咐20-50分钟后，抽滤液 经V24输送到干燥单元进行干燥。干燥后粉未为淡粉红色。
实施例一：半脱脂牛奶993升，温度8.2度C, pH6. 6，总蛋白为32. 5克每升， BLP浓度366亳克每升，BLF浓度为138毫升每升。采用图l的工艺路线，并按说明 所描述的步骤生产BLP与BLF的混合蛋白粉。搅拌罐T2内装SPEC70树脂。吸咐时 间115分钟。解咐时加入5.5%氯化钠盐水90升，解咐时间65分钟。解咐及淋洗液 合并到微滤单元（O. l微米微滤膜）进行微滤除菌除脂肪。滤液136升输送到超滤 膜单元（3QK分子截止量)进行脱盐浓缩。收得浓缩液Q.52升。釆用冷冻干燥方法 得淡棕绿色干粉351克，含水4. 3%，总蛋白为93. 2%,灰分2. 6%。
实施例二：脱脂牛奶996升，pH6. 7,温度6. 6度C总蛋白为32. 9克每升，BLP 浓度为378毫克每升，BLF浓度为129毫克每升。采用图l的工艺路线，并按说明 中所描述的步骤生产单体的BLP蛋白及单体的BLF蛋白。加入内装有SPEC70树脂 搅拌罐吸咐115分钟，搅拌速度为60rpm。收集己吸咁过的牛奶后，用RO水淋洗 树脂。加入第一级盐水（2.4W90升解咐36分钟，搅拌速度30rpm。收集第一级BLP 解咐液并加2. 3%盐水淋洗树脂3次。合并淋洗液到BLP解咐液中后用微滤膜除菌 及脂肪。
在BLP微滤同时，加入86升4.W盐水于搅拌罐中进行BLF解咐，搅拌速度 36rpm。解咐时间60分钟。收集解咐液后用RO水淋洗树脂。合并淋洗液到解咐液 中共得151升。输送到微滤单元进行除菌及除脂肪。滤液输送到超滤单元（30K 分子截止量）并加水进行脱盐（洗到离子强度低于l. 6毫西门）浓缩至1%蛋白浓度
分子截止量）并加水进行脱盐（洗到离子强度低于l. 6毫西门）浓缩至1%蛋白浓度
时（7.6升），输送到CM树脂罐除去杂蛋白。然后继续用超滤膜浓缩到O. 39升后送 至冷冻干燥单元干燥得淡粉红色粉未80.5克。粉未含水3.1%,灰份1.1%,总蛋 白为96. 5%。
微滤后的BLP输送超滤单元加水脱盐（洗到离子强度低于1.6毫西门）后， 继续浓縮。收集BLP浓缩液0.73升。用冷冻干燥法干燥得棕绿色粉未351克， 粉未含水4. 2%,灰份2. 1%,总蛋白为94. 1%。