一种纯生啤酒膜清洗再生酶制剂及清洗方法

一种纯生啤酒膜清洗再生酶制剂及清洗方法

技术领域

[0001] 本发明属于发酵工程领域，涉及啤酒发酵生产行业，具体是一种纯生啤酒膜清洗再生酶制剂及清洗方法。

背景技术

[0002] 纯生啤酒的生产中采用低温微孔滤膜过滤除菌工艺取代传统的巴氏热杀菌过程，使啤酒的口味更新鲜、纯正、富有营养，深受消费者的青睐。纯生啤酒生产技术的关键为无菌酿造、无菌过滤与无菌灌装，而微孔滤膜过滤技术是纯生啤酒生产的核心。纯生啤酒的膜过滤系统，目前国内外啤酒厂一般采用粗、终两套过滤系统对清酒进行过滤，利用其精细的物理过滤特性(粗滤0.65 μ m,终滤0.45 μ m),将酒液中的啤酒酵母、有害微生物和一部分蛋白多酚等阻隔和过滤，保证纯生啤酒的生物与非生物稳定性，从而保证啤酒的营养、质量和风味稳定性。由于啤酒发酵液中存在一些膜堵物质，堵塞膜孔后形成的膜污染可大大降低膜的滤过速度和酒液滤过量。为了减少膜堵塞问题，纯生啤酒发酵普遍采取选用高成本的澳麦、加麦等优质麦芽进行酿造，并针对纯生啤酒原料的特点对糖化工艺进行控制，减少半纤维素等的含量以减低对膜堵塞的影响；在清酒过滤时还通过使用硅藻土、硅胶与PVPP来辅助滤膜的过滤，在膜过滤生产后还必须要有清洗再生工艺，清洗除去膜孔中的堵塞物，使膜通量再生恢复。膜清洗再生工艺主要有①物理法清洗:如热水法、海绵球洗净法、反压冲洗和循环洗涤等化学法:酸/碱清洗；③机械刮除方法等。目前在纯生啤酒的生产中，膜过滤结束后的清洗再生工艺主要使用化学法，先用水漂洗，除去附着在膜上的蛋白质、酒花树脂等杂质，接着按照顺序用温水、热碱、热水、冷水进行清洗和再生。但微孔滤膜过滤一定量的酒液后其膜通量就迅速下降，采用以上化学法清洗再生工艺则再生效率很差，需更换膜以达到过滤要求。目前各啤酒厂配备的膜过滤系统以进口 Sartorius、Pall和Seitz公司的产品较多，更换一套新过滤膜约20-40万元，导致纯生啤酒的运行成本较高。

[0003] 膜的清洗再生，除了可以用酸、碱、表面活性剂等化学试剂洗去吸附在膜面和膜孔的污染物以外，对于大分子的污染物，还可以用相应的酶来水解成小分子，减低污染物的吸附和堵塞作用，进而易于从膜面和膜孔中清洗除去。酶法清洗可使膜性能恢复程度高，且不会对膜造成任何损害，这已在一些新兴膜浓缩、膜分离行业得到了应用。如中国专利CN100503818C发明了一种用于果蔬汁超滤浓缩工艺的超滤膜清洗酶及提高超滤膜通量的生产方法，针对果蔬汁膜过滤中的主要污染物成分果胶、纤维素、半纤维素、蛋白质等，设计了果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶等组分，分解膜表面的滞留物质，提高化学清洗剂清洗效果，改善膜通量，解决了果蔬汁浓缩生产上出现的超滤膜堵塞，膜污染，膜处理能力降低的问题。中国专利CN 101457182B发明了一种含有蛋白酶的液体膜清洗剂，用于主要有机污染物为蛋白质类大分子的生物发酵液分离用陶瓷膜的清洗，不仅缩短了清洗时间，还能减缓膜通量衰减速度，降低清洗频率。一些研究报道也表明，用胰蛋白酶溶液清洗被酱油、红霉素、肌酐发酵液污染的陶瓷膜，可以比酸/碱清洗法缩短清洗时间，提高滤料通量。发明内容

[0004] 本发明的目的是针对纯生啤酒膜过滤中主要的大分子膜堵物质，提供可水解这些膜堵物质的酶组分的组合，有效水解大分子为小片段，易于从膜面和膜孔中清洗除去；并提供一种酶法和化学法结合的，使纯生啤酒滤膜在生产后膜通量能够具有良好的再生恢复效果，提高膜的滤酒能力。

[0005]本发明解决上述技术问题的技术方案如下:

[0006] 1.一种用于纯生啤酒膜清洗再生的酶制剂由清洗再生酶I和清洗再生酶II组成；

[0007] I)清洗再生酶I由戊聚糖酶、β -葡聚糖酶和甘露聚糖酶组成,其活力范围是:若戊聚糖酶的酶活力以lOOOOU/g计，β -葡聚糖酶的酶活力以20000U/g计，甘露聚糖酶的酶活力以lOOOOU/g计时，戊聚糖酶、β-葡聚糖酶和甘露聚糖酶的质量百分比如下:

[0008] 戊聚糖酶 40-80%

[0009] β-葡聚糖酶 10-50%

[0010] 甘露聚糖酶 2-20%

[0011] 2)清洗再生酶II由脯氨酸内切蛋白酶和中性蛋白酶组成，其活力范围是:若脯氨酸内切蛋白酶的酶活力以5U/g计，中性蛋白酶的酶活力以100000U/g计时，脯氨酸内切蛋白酶和中性蛋白酶的质量百分比如下:

[0012] 脯氨酸内切蛋白酶 40-80%

[0013] 中性蛋白酶 20-60%

[0014] 本发明的纯生啤酒膜清洗再生酶各组分，均由微生物发酵产生，各组分的卫生要求均符合我国《食品安全国家标准食品工业用酶制剂》(GB 255942010)或联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会(JECFA)、美国食品化学法典(FCC)关于食品加工用酶制剂的卫生要求。戊聚糖酶的基因可来源于黑曲霉、李氏木霉、绿色木霉、棉状嗜热丝孢菌、毕赤酵母、孤独腐质霉、枯草芽孢杆菌、米曲霉等，β -葡聚糖酶的基因来源可以是地衣芽孢杆菌、孤独腐质霉、哈次木霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、李氏木霉、解淀粉芽孢杆菌、绿色木霉、Disporotrichum dimorphosporum、Talaromyces emersonii 等，甘露聚糖酶的基因来源可以来源于枯草芽孢杆菌、黑曲霉、李氏木霉、链霉菌等，脯氨酸内切蛋白酶的基因来源可以来源于黑曲霉、点状产气单胞菌、黄单胞菌等，中性蛋白酶的基因来源可以来源于枯草芽孢杆菌等；但均不限于以上的菌株。

[0015] 2.纯生啤酒膜过滤后进行的酶法膜清洗再生方法，按以下步骤进行:

[0016] I)常规水洗和碱法清洗

[0017] (I)在碱液罐中准备55°C热水(约75%液位)，打入膜过滤系统保温循环30分钟。

[0018] (2)将膜过滤系统及管路中残水排空，适当进行备压排放；再打入55°C热水，充满过滤机，进行浸泡约40小时。

[0019] (3)将膜过滤系统的浸泡液排空，在膜过滤系统操作平台设定用约2吨冷水冲洗膜过滤系统。

[0020] (4) CIP系统手动控制进行冷水冲洗碱罐5分钟，排空浙干。

[0021] (5)配制碱性清洗剂，pH值10-12，进入膜过滤系统碱再生处理程序。

[0022] (6)按系统程序进行完整性测试。[0023] 2)清洗再生酶I清洗

[0024] (1)称取膜清洗再生酶1 0.5-2.0kg,用5L左右45°C温水充分搅拌溶解。

[0025] (2)取洁净纱布分别折叠成4、8、16层，将上述膜清洗再生酶I溶液逐级过滤至清。

[0026] (3)将步骤(2)过滤至清的膜清洗再生酶I溶液用洁净桶盛装，并置于4°C以下低温保存至使用，时间不超过3天。

[0027] (4)排空CIP系统碱液罐中的碱性清洗液，用冷水冲洗至pH试纸检测为中性。

[0028] (5)在碱液罐中准备55°C热水，将保存的澄清膜再生酶I溶液加入热水中，热水量使酶液稀释1000倍，保温循环30分钟。

[0029] (6)将膜过滤系统及管路中残水排空，将步骤(5)稀释的酶液打入膜过滤系统中，适当进行备压排放，保证充满膜过滤机，进行浸泡12-40小时(无需再加热)。

[0030] 3)清洗再生酶II清洗

[0031] (1)称取膜清洗再生酶II 0.5-2.0kg，加5L 37°C温水充分搅拌溶解。

[0032] (2)排空CIP系统碱液罐中的清洗液，用冷水冲洗至pH试纸检测为中性。

[0033] (3)在碱液罐中准备37°C热水，将保存的澄清膜再生酶溶液加入中，热水量使酶液稀释2000倍，保温循环30分钟。

[0034] (4)将膜过滤系统及管路中残水排空，将步骤(3)稀释的酶液打入膜过滤系统中，适当进行备压排放，保证充满过膜过滤机，进行浸泡12-40小时(无需再加热)；浸泡结束后，进行无菌取样检测细菌含量。

[0035] 4)水洗

[0036] 步骤3)结束后将膜过滤系统的浸泡液排空，在膜过滤系统操作平台设定用2-10吨冷水冲洗膜过滤系统。

[0037] 5)碱性清洗剂循环:

[0038] 配制碱性清洗剂，pH值10-12，进入膜过滤系统碱再生处理程序，热水及碱液加热到55-60°C，在膜过滤系统操作面板上选择所要再生的线进行清洗。再生完成后，膜过滤系统自动进行完整性测试；通过操作面板上可察看完整性测试情况，ΛΡ < 70mbar。如果ΔΡ ^ 70mbar可用冷水反复冲洗数次，直至压差尽可能降下来。

[0039] 6)完整性测试:

[0040] 完整性测试时间10分钟，滤芯润湿后在20°C ±5°C下进行完整性测试。用压缩空气或氮气给过滤器施加3bar的正向压力，在这个过程中通过压力使过滤器内的水从测试阀排出，打开排污阀将全部的残留水排净；缓慢将过滤器压力升至1.2bar的测试压力，然后关闭气体进口阀门，等待5分钟使其达到稳定状态。

[0041] 本发明的优点是:使用本发明的纯生啤酒膜清洗再生酶和清洗方法，可显著提高膜的再生恢复能力，延长膜的使用寿命，提高每套微滤膜的滤酒量35%以上，节约膜的使用成本。

具体实施方式

[0042] 为实现本发明，事先进行试验，将纯生啤酒膜过滤生产后的滤膜解剖，收集膜堵物质，分析其主要成分及其性质，并用多种酶类进行水解反应，从中筛选对膜堵物质具有良好水解作用的酶种及其使用浓度。试验研究表明，纯生啤酒膜过滤生产中的大分子膜堵物质，主要包括蛋白质和蛋白质-多酚化合物、戊聚糖、β -葡聚糖等。

[0043] 从纯生啤酒膜堵物质中分离出的醇溶性物质，主要是蛋白质和蛋白质-多酚化合物。这些蛋白质是富含脯氨酸的大麦醇溶蛋白，由于脯氨酸的五元吡咯环结构的存在，蛋白质肽键前的脯氨酸氨基氮上缺少一个氢原子，使环结构前的羰基氧成为强的氢原子受体，这样来源于麦芽和酒花的多酚类物质不仅通过疏水作用与蛋白质聚合，还通过氢键与醇溶性蛋白富含脯氨酸的区域进一步稳定它们之间的聚合。这些稳定的聚合物在膜面形成浓差极化时容易析出、沉淀在膜面和膜孔中，形成了纯生啤酒膜污染的重要来源。脯氨酸内切蛋白酶是专一性水解多肽中脯氨酸残基的羧基端肽键位点，可将纯生啤酒滤膜中的这些富含脯氨酸的蛋白质和蛋白质-多酚聚合物较充分地水解为短肽，减少蛋白质和多酚形成的聚合，从而易于从膜面和膜孔中清洗除去；酶切位点特异性较低的中性蛋白酶也可以有较好的作用。而其它的蛋白酶，如木瓜蛋白酶水解蛋白质的主要位点是下一个氨基酸为精氨酸残基的位置，胰蛋白酶水解蛋白质的位点是由赖氨酸、精氨酸的羧基形成的肽键，糜蛋白酶主要识别肽链中的苯丙氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸残基，弹性蛋白酶的识别位点为肽链中的缬氨酸、亮氨酸、丝氨 酸等脂肪族氨基酸残基，胃蛋白酶则识别和切断酪氨酸、苯丙氨酸等氨基端的肽键，皆不能很好地水解富含脯氨酸的蛋白质和蛋白质-多酚聚合物。

[0044] 从纯生啤酒膜堵物质中分离出的多糖类物质，主要是来源于麦芽但在糖化过程中未能充分降解的半纤维素类如戊聚糖、β -葡聚糖等，以及来源于啤酒发酵后期酵母自溶时产生的甘露聚糖等。这些多聚糖物质在纯生啤酒膜过滤时，醪液运动形成的剪切力能将醪液中无规则、无规律排列的多聚糖分子扩展、联结在一起，通过氢键形成多聚糖胶体物质，在膜过滤过程中通过浓差极化和膜污染沉积在膜表面和膜孔中。这些多聚糖可由相应的戊聚糖酶、β -葡聚糖酶、甘露聚糖酶等水解成小分子的糖，易于从膜面和膜孔中清洗除去。

[0045] 下面结合实施例对本发明做进一步的描述。

[0046] 本发明所采用的戊聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、脯氨酸内切蛋白酶、中性蛋白酶等原料均可通过市售方式加以购买。

[0047] 实施例1

[0048] 某一纯生啤酒生产中清洗再生酶的制备与膜清洗

[0049] 原料组成:清洗再生酶1、清洗再生酶II。

[0050] 清洗再生酶1:

[0051] 戊聚糖酶375g，β -葡聚糖酶100g，甘露聚糖酶25g。

[0052] 制备方法:将戊聚糖酶、β -葡聚糖酶、甘露聚糖酶在无菌环境下按上述比例通过机械混均即可。

[0053] 清洗再生酶I1:

[0054] 脯氨酸内切蛋白酶250g，中性蛋白酶250g。

[0055] 制备方法:将脯氨酸内切蛋白酶、中性蛋白酶在无菌环境下按上述比例通过混均即可。

[0056] 膜清洗:

[0057] 一套微孔滤膜(0.45 μ m, 750mm, 36支)按生产要求过滤纯生啤酒，然后按常规酸碱清洗方式进行再生:在碱液罐中准备55°C热水，打入膜过滤系统保温循环30分钟；将膜过滤系统及管路中残水排空，进行备压排放，再打入55°C热水，保证充满过滤机，进行浸泡40小时；将膜过滤系统的浸泡液排空,在膜过滤系统操作平台设定用2吨冷水冲洗膜过滤系统；CIP系统手动控制进行冷水冲洗碱罐5分钟，排空浙干；配制碱性清洗剂，进入膜过滤系统碱再生处理程序。

[0058] 取膜清洗再生酶I 0.5kg，用5L温度为45°C的温水充分搅拌溶解，过滤至清亮；排空CIP系统碱液罐中的碱性清洗液，用5-8°C冷水冲洗至pH试纸检测为6.8-7.2 ;将膜过滤系统及管路中的残水排空，把上述酶液打入膜过滤系统中，用0.2kg压力进行备压排放，保证充满过膜过滤机，进行浸泡30小时；

[0059] 取膜清洗再生酶II 0.5kg，加5L温度为37°C的温水充分搅拌溶解，过滤至清亮；排空CIP系统碱液罐中的清洗液，用5-8°C冷水冲洗至pH试纸检测为6.8-7.2 ;将膜过滤系统及管路中的残水排空，把上述酶液打入膜过滤系统中，用0.2kg压力进行备压排放，保证充满过膜过滤机，进行浸泡30小时，浸泡结束后，进行无菌取样检测细菌含量。

[0060] 取样后将膜过滤系统的浸泡液排空，在膜过滤系统操作平台设定用5吨冷水冲洗膜过滤系统，经碱性清洗剂循环后通过完整性测试。结果如表1所示。

[0061 ] 表1常规化学清洗再生效果[0062]

[0063] 一套微孔滤膜(0.45 μ m, 750mm, 36支)按生产要求过滤纯生啤酒，然后按本发明所述清洗再生酶清洗方法进行再生，结果如表2所示。

[0064] 表2酶法清洗再生效果

[0065]

[0066] 实施例2

[0067] 另一纯生啤酒生产中清洗再生酶的制备与膜清洗

[0068] 原料组成:清洗再生酶1、清洗再生酶II。

[0069] 清洗再生酶1:

[0070] 戊聚糖酶375g，β -葡聚糖酶200g，甘露聚糖酶25g。

[0071] 制备方法:将戊聚糖酶、β -葡聚糖酶、甘露聚糖酶在无菌环境下按上述比例通过机械混均即可。

[0072] 清洗再生酶I1:

[0073] 脯氨酸内切蛋白酶300g，中性蛋白酶200g。

[0074] 制备方法:将脯氨酸内切蛋白酶、中性蛋白酶在无菌环境下按上述比例通过混均即可。

[0075] 生产试验:

[0076] 一套微孔滤膜(0.45 μ m, 750mm, 36支)按生产要求过滤纯生啤酒，然后按常规酸碱清洗方式进行再生:在碱液罐中准备55°C热水，打入膜过滤系统保温循环30分钟；将膜过滤系统及管路中残水排空，进行备压排放，再打入55°C热水，保证充满过滤机，进行浸泡40小时；将膜过滤系统的浸泡液排空,在膜过滤系统操作平台设定用2吨冷水冲洗膜过滤系统；CIP系统手动控制进行冷水冲洗碱罐5分钟，排空浙干；配制碱性清洗剂，进入膜过滤系统碱再生处理程序。

[0077] 取膜清洗再生酶I 0.6kg，用4.5L 45°C温水充分搅拌溶解、过滤至清亮；排空CIP系统碱液罐中的碱性清洗液，用5-8°C冷水冲洗至pH试纸检测为6.8-7.2 ;将膜过滤系统及管路中的残水排空，把上述酶液打入膜过滤系统中，用0.2kg压力进行备压排放，保证充满过膜过滤机，进行浸泡25小时；

[0078] 取膜清洗再生酶II 0.5kg，加4.5L37°C温水充分搅拌溶解、过滤至清亮；排空CIP系统碱液罐中的清洗液，用5-8°C冷水冲洗至pH试纸检测为6.8-7.2 ;将膜过滤系统及管路中的残水排空，把上述酶液打入膜过滤系统中，用0.2kg压力进行备压排放，保证充满过膜过滤机，进行浸泡25小时，浸泡结束后，进行无菌取样检测细菌含量。[0079] 取样后将膜过滤系统的浸泡液排空，在膜过滤系统操作平台设定用5吨冷水冲洗膜过滤系统，经碱性清洗剂循环后通过完整性测试。结果如表3所示。

[0080] 表3常规化学清洗再生效果

[0081]

[0082] 一套微孔滤膜(0.45 μ m，750mm，36支)按生产要求过滤纯生啤酒，然后按本发明所述清洗再生酶清洗方法进行再生，结果如表4所示。

[0083] 表4酶法清洗再生效果

[0084]

[0085] 实施例3[0086] 另一纯生啤酒生产中清洗再生酶的制备与膜清洗

[0087] 原料组成:清洗再生酶1、清洗再生酶II。

[0088] 清洗再生酶1:

[0089] 戊聚糖酶315g，β -葡聚糖酶315g，甘露聚糖酶70g。

[0090] 制备方法:将戊聚糖酶、β -葡聚糖酶、甘露聚糖酶在无菌环境下按上述比例通过机械混均即可。

[0091] 清洗再生酶I1:

[0092] 脯氨酸内切蛋白酶375g，中性蛋白酶125g。

[0093] 制备方法:将脯氨酸内切蛋白酶、中性蛋白酶在无菌环境下按上述比例通过混均即可。

[0094] 生产试验:

[0095] 一套微孔滤膜(0.45 μ m, 750mm, 36支)按生产要求过滤纯生啤酒，然后按常规酸碱清洗方式进行再生:在碱液罐中准备55°C热水，打入膜过滤系统保温循环30分钟；将膜过滤系统及管路中残水排空，进行备压排放，再打入55°C热水，保证充满过滤机，进行浸泡40小时；将膜过滤系统的浸泡液排空,在膜过滤系统操作平台设定用2吨冷水冲洗膜过滤系统；CIP系统手动控制进行冷水冲洗碱罐5分钟，排空浙干；配制碱性清洗剂，进入膜过滤系统碱再生处理程序。

[0096] 取膜清洗再生酶I 0·.7kg，用4.5L 45°C温水充分搅拌溶解，过滤至清亮；排空CIP系统碱液罐中的碱性清洗液，用5-8°C冷水冲洗至pH试纸检测为6.8-7.2 ;将膜过滤系统及管路中的残水排空，把上述酶液打入膜过滤系统中，用0.2kg压力进行备压排放，保证充满过膜过滤机，进行浸泡20小时；

[0097] 取膜清洗再生酶II 0.5kg，加4.5L37°C温水充分搅拌溶解、过滤至清亮；排空CIP系统碱液罐中的清洗液，用5-8°C冷水冲洗至pH试纸检测为6.8-7.2 ;将膜过滤系统及管路中的残水排空，把上述酶液打入膜过滤系统中，用0.2kg压力进行备压排放，保证充满过膜过滤机，进行浸泡20小时，浸泡结束后，进行无菌取样检测细菌含量。

[0098] 取样后将膜过滤系统的浸泡液排空，在膜过滤系统操作平台设定用5吨冷水冲洗膜过滤系统，经碱性清洗剂循环后通过完整性测试。结果如表5所示。

[0099] 表5常规化学清洗再生效果

[0100]

[0101] 一套微孔滤膜(0.45 μ m, 750mm, 36支)按生产要求过滤纯生啤酒，然后按本发明所述清洗再生酶清洗方法进行再生，结果如表6所示。

[0102] 表6酶法清洗再生效果

[0103]

[0104] 以上所述的实施例，是本发明在纯生啤酒生产中较好的具体应用，但本发明的具体技术内容和应用并不受实施例的局限。